Přeskočit na obsah

Polymerázová řetězová reakce

Z Infopedia
Rozbalit box

Obsah boxu

Šablona:Infobox metoda

Polymerázová řetězová reakce (zkratka PCR z anglického Polymerase Chain Reaction) je klíčová a široce využívaná metoda molekulární biologie, která umožňuje rychlé a cílené zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA v laboratorních podmínkách. Během několika hodin dokáže z jediné molekuly DNA vytvořit miliony až miliardy identických kopií. Díky své vysoké citlivosti a specifičnosti způsobila PCR revoluci v medicíně, genetice, forenzní vědě i základním výzkumu. Metodu vyvinul v roce 1983 americký biochemik Kary Mullis, za což v roce 1993 obdržel Nobelovu cenu za chemii.

📜 Historie

Myšlenka na cyklickou amplifikaci DNA se zrodila v hlavě Karyho Mullise během noční jízdy autem v Kalifornii v roce 1983. Mullis tehdy pracoval pro biotechnologickou společnost Cetus Corporation. Původní protokol byl však zdlouhavý a neefektivní, protože vyžadoval po každém cyklu zahřátí (denaturaci) přidání nové dávky DNA polymerázy, která se vysokou teplotou zničila.

Zásadní průlom nastal v roce 1986, kdy byla do reakce nasazena termostabilní DNA polymeráza izolovaná z bakterie Thermus aquaticus. Tato bakterie žije v horkých pramenech Yellowstonského národního parku a její enzymy jsou přizpůsobeny vysokým teplotám. Tato polymeráza, známá jako Taq polymeráza, odolává teplotám potřebným k denaturaci DNA (kolem 95 °C) a umožnila automatizaci celého procesu v jediném přístroji – termocykléru. Tento objev proměnil PCR v rutinní, rychlou a dostupnou metodu, která se rychle rozšířila do laboratoří po celém světě.

⚙️ Princip metody

PCR napodobuje přirozený proces replikace DNA, který probíhá v buňkách, ale je zacílen pouze na velmi specifický úsek. Celý proces probíhá v cyklech, přičemž každý cyklus se skládá ze tří základních kroků řízených teplotou:

1. Denaturace

Reakční směs se zahřeje na vysokou teplotu, obvykle 94–96 °C. Při této teplotě dojde k narušení vodíkových vazeb, které drží pohromadě dva řetězce dvoušroubovice DNA, a dvoušroubovice se rozplete na dva samostatné (jednovláknové) řetězce. Tyto řetězce slouží v dalším kroku jako matrice (templáty) pro syntézu nových vláken.

2. Nasedání primerů (Annealing)

Teplota se sníží na 50–65 °C (přesná teplota závisí na délce a složení primerů). Při této teplotě se na specifická místa na templátových vláknech DNA navážou krátké, uměle syntetizované jednovláknové úseky DNA zvané primery. Primery jsou komplementární k začátku a konci úseku DNA, který chceme amplifikovat. Ohraničují tak cílovou sekvenci a poskytují volný 3'-konec, na který může DNA polymeráza navázat a začít syntézu.

3. Elongace (Extension/Synthesis)

Teplota se opět zvýší na optimální pracovní teplotu pro danou DNA polymerázu, což je v případě Taq polymerázy obvykle 72 °C. Termostabilní DNA polymeráza začne od nasednutého primeru syntetizovat nový řetězec DNA podle templátu. Přidává přitom volné nukleotidy (dNTPs) z reakční směsi v souladu s pravidly komplementarity (A s T, C s G).

Tyto tři kroky tvoří jeden cyklus. Po jeho dokončení se počet kopií cílového úseku DNA zdvojnásobí. Celý cyklus se opakuje 25–40krát, což vede k exponenciálnímu nárůstu počtu kopií. Po 30 cyklech může z jediné původní molekuly DNA vzniknout více než miliarda kopií.

🧪 Komponenty reakce

Pro úspěšné provedení PCR je nutné smíchat několik klíčových složek v malé zkumavce:

  • Vzorek DNA (templátová DNA): Jakákoliv DNA, která obsahuje cílovou sekvenci určenou k amplifikaci. Může pocházet z krve, slin, vlasů, bakterií, virů nebo jakéhokoliv jiného biologického materiálu.
  • Primery: Dva typy krátkých, syntetických jednovláknových DNA (obvykle 18–25 nukleotidů dlouhých). Jeden primer je komplementární k začátku cílové sekvence na jednom vlákně (forward primer) a druhý ke konci cílové sekvence na druhém vlákně (reverse primer). Jejich návrh je klíčový pro specifičnost reakce.
  • Termostabilní DNA polymeráza: Enzym, který katalyzuje syntézu nových DNA řetězců. Nejznámější je Taq polymeráza, ale používají se i jiné polymerázy s vyšší přesností (např. Pfu polymeráza).
  • Deoxynukleotidtrifosfáty (dNTPs): Stavební kameny DNA – dATP, dGTP, dCTP a dTTP. Polymeráza je používá k tvorbě nového řetězce.
  • Pufr: Roztok, který udržuje stabilní pH a obsahuje ionty nezbytné pro funkci polymerázy, především ionty hořčíku (Mg²⁺), které slouží jako kofaktor.
  • Voda: Obvykle deionizovaná a sterilní voda, která tvoří zbytek objemu reakční směsi.

Všechny tyto komponenty se smíchají a vloží do přístroje zvaného termocyklér, který automaticky a přesně mění teploty podle naprogramovaných cyklů.

🔬 Varianty a modifikace

Základní metoda PCR byla postupem času upravena pro specifické účely, což vedlo ke vzniku mnoha variant:

  • Real-Time PCR (qPCR): Kvantitativní PCR umožňuje sledovat a měřit množství amplifikované DNA v reálném čase během reakce. Toho je dosaženo přidáním fluorescenčních barviv nebo sond do reakční směsi. Intenzita fluorescence je přímo úměrná množství vytvořeného produktu. Používá se pro stanovení virové nálože (např. u HIV nebo hepatitidy C), měření genové exprese nebo kvantifikaci GMO v potravinách.
  • Reverzní transkripce PCR (RT-PCR): Tato varianta slouží k amplifikaci RNA namísto DNA. V prvním kroku je RNA pomocí enzymu reverzní transkriptáza přepsána do komplementární DNA (cDNA). Tato cDNA pak slouží jako templát pro standardní PCR. RT-PCR je nepostradatelná pro detekci RNA virů (např. SARS-CoV-2, virus chřipky) a pro studium genové exprese na úrovni mRNA.
  • Digitální PCR (dPCR): Vysoce přesná metoda pro absolutní kvantifikaci DNA. Vzorek je rozdělen do tisíců až milionů mikroskopických reakčních komůrek (kapek), z nichž každá obsahuje buď žádnou, jednu, nebo několik málo molekul templátu. Po proběhnutí PCR se vyhodnotí, v kolika komůrkách došlo k amplifikaci. To umožňuje velmi přesné stanovení původního počtu molekul bez nutnosti kalibrační křivky.
  • Multiplex PCR: Umožňuje amplifikaci několika různých cílových sekvencí v jedné reakci současně. Používá se více párů primerů, z nichž každý je specifický pro jiný cíl. Využívá se v diagnostice pro současnou detekci více patogenů nebo v kriminalistice pro analýzu více mikrosatelitních markerů najednou.
  • Nested PCR (hnízdová PCR): Dvoukolová PCR pro zvýšení citlivosti a specifičnosti. V prvním kole se amplifikuje větší úsek DNA. Produkt této reakce se poté použije jako templát pro druhé kolo PCR s druhým párem primerů, které cílí na sekvenci uvnitř prvního produktu.

💡 Využití a aplikace

PCR se stala nepostradatelným nástrojem v mnoha oblastech:

⚖️ Výhody a nevýhody

Výhody

  • Vysoká citlivost: Dokáže detekovat i jedinou molekulu DNA v komplexním vzorku.
  • Vysoká specifičnost: Díky specifickým primerům je amplifikován pouze požadovaný úsek DNA.
  • Rychlost: Výsledky jsou k dispozici během několika hodin, na rozdíl od dnů či týdnů u starších metod (např. kultivace bakterií).
  • Robustnost: Metoda je relativně jednoduchá na provedení a lze ji snadno automatizovat.

Nevýhody

  • Náchylnost ke kontaminaci: Kvůli extrémní citlivosti může i nepatrná kontaminace cizí DNA (např. z laboranta nebo z jiného vzorku) vést k falešně pozitivním výsledkům. Vyžaduje proto velmi přísné sterilní podmínky.
  • Nutnost znalosti sekvence: Pro návrh primerů je nutné znát alespoň okrajové sekvence cílové oblasti DNA.
  • Omezená délka produktu: Standardní PCR je efektivní pro amplifikaci úseků o délce několika set až několika tisíc párů bází. Amplifikace velmi dlouhých fragmentů je obtížná.
  • Chybovost polymerázy: Některé polymerázy (zejména Taq) nemají korekční (proofreading) aktivitu a mohou při syntéze občas zařadit špatný nukleotid, což vede ke vzniku mutací v produktu.

🧑‍🏫 Pro laiky

Polymerázovou řetězovou reakci si lze představit jako molekulární kopírku na DNA.

Představte si, že máte obrovskou knihovnu (to je celý genom organismu) a potřebujete si udělat milion kopií jediné konkrétní stránky (to je specifický gen nebo úsek DNA, který vás zajímá).

1. Najít správnou stránku: Použijete dvě speciální záložky (to jsou primery). Jednu dáte na začátek stránky a druhou na její konec. Tím přesně označíte, co se má kopírovat. 2. Otevřít knihu: Knihu (dvoušroubovici DNA) musíte "otevřít", aby byla stránka čitelná. V PCR se to dělá zahřátím (denaturace), které od sebe oddělí oba řetězce DNA. 3. Přiložit záložky: Po zchlazení se záložky (primery) samy přichytí na správná místa na začátku a na konci stránky (nasedání). 4. Spustit kopírování: Přijde na řadu samotná kopírka (enzym DNA polymeráza), která použije papír a toner (stavební bloky dNTPs) a podle originální stránky vytvoří její přesnou kopii (elongace).

Tento proces (otevřít, označit, kopírovat) se opakuje stále dokola. Po prvním kole máte dvě kopie stránky, po druhém čtyři, po třetím osm a tak dále. Po zhruba 30 kolech máte přes miliardu kopií jediné původní stránky, což je dostatečné množství pro další analýzu.


Šablona:Aktualizováno

Citováno z „https://infopedia.cz/index.php?title=Polymerázová_řetězová_reakce&oldid=14791“