DNA polymeráza

Rozbalit box

Obsah boxu

DNA polymeráza (někdy zkracováno jako DNA pol) je klíčový enzym, který se účastní syntézy nových řetězců DNA z jednotlivých deoxynukleotidů. Hraje ústřední roli v procesu replikace DNA, který umožňuje buňkám se dělit a předávat genetickou informaci dceřiným buňkám. Kromě replikace je nezbytná také pro opravné mechanismy, které odstraňují poškození v molekule DNA.

Tento enzym funguje jako "molekulární kopírka". Čte existující řetězec DNA (templát) a podle něj sestavuje nový, komplementární řetězec. Proces syntézy probíhá vždy ve směru od 5' konce k 3' konci nově vznikajícího řetězce. Pro zahájení své činnosti vyžaduje DNA polymeráza krátký startovací úsek, tzv. primer, což je krátká sekvence RNA nebo DNA, na kterou může navázat první nukleotid.

DNA polymerázy jsou přítomny ve všech formách života, od bakterií a archeí po eukaryotické organismy, včetně člověka. Existuje mnoho různých typů DNA polymeráz, které se liší svou strukturou, funkcí a přesností. Některé jsou specializované na rychlou replikaci celého genomu, zatímco jiné se zaměřují na opravy chyb nebo překonávání poškozených úseků DNA.

📜 Historie objevu

Objev DNA polymerázy je neoddělitelně spjat se jménem amerického biochemika Arthura Kornberga. V roce 1956 Kornberg se svým týmem úspěšně izoloval z bakterie Escherichia coli enzym, který byl schopen syntetizovat DNA v laboratorních podmínkách (in vitro). Tento enzym byl později pojmenován DNA polymeráza I (Pol I).

Kornberg prokázal, že pro syntézu DNA jsou nezbytné čtyři základní složky:

1. Všechny čtyři typy deoxynukleosidtrifosfátů (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) jako stavební kameny.
2. Templátový (vzorový) řetězec DNA, který enzym "čte".
3. Primer, krátký úsek nukleové kyseliny s volným 3'-OH koncem, na který se mohou navazovat nové nukleotidy.
4. Ionty hořčíku (Mg²⁺) jako kofaktor.

Za tento zásadní objev, který položil základy molekulární biologie a genetického inženýrství, obdržel Arthur Kornberg v roce 1959 Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu společně se Severem Ochoou. Později se ukázalo, že DNA polymeráza I není hlavním replikačním enzymem u E. coli, ale plní spíše pomocné a opravné funkce. Hlavní replikační enzym, DNA polymeráza III, byl objeven až v roce 1970 Thomasem Kornbergem, synem Arthura Kornberga.

⚙️ Funkce a mechanismus

DNA polymeráza katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi 3'-hydroxylovou skupinou posledního nukleotidu na rostoucím řetězci a 5'-fosfátovou skupinou nově příchozího deoxynukleosidtrifosfátu (dNTP). Energie pro tuto vazbu je získána odštěpením dvou fosfátových skupin (pyrofosfátu) z dNTP.

🧬 Polymerační aktivita (5'→3')

Hlavní funkcí je syntéza (polymerace) nového řetězce DNA. Enzym se pohybuje po templátovém řetězci ve směru 3'→5' a syntetizuje nový řetězec ve směru 5'→3. To znamená, že nové nukleotidy jsou vždy přidávány na 3' konec rostoucího řetězce. Výběr správného nukleotidu je dán principem komplementarity: adenin (A) se páruje s thyminem (T) a guanin (G) se páruje s cytosinem (C).

✂️ Exonukleázová aktivita

Mnoho DNA polymeráz má kromě polymerační aktivity také exonukleázovou aktivitu, což znamená, že dokáží odštěpovat nukleotidy z konců řetězce DNA. Tato funkce je klíčová pro přesnost replikace a opravy DNA.

• 3'→5' exonukleázová aktivita (proofreading): Tato funkce slouží jako "korektura" nebo "opravné čtení" (angl. proofreading). Pokud polymeráza omylem zařadí nesprávný nukleotid, vzniklý nesoulad v dvoušroubovici je detekován. Enzym se zastaví, posune se o krok zpět, pomocí 3'→5' exonukleázové aktivity chybný nukleotid odstraní a nahradí ho správným. Tím se dramaticky zvyšuje přesnost (věrnost) replikace DNA.
• 5'→3' exonukleázová aktivita: Tuto aktivitu má například prokaryotická DNA polymeráza I. Umožňuje enzymu odstraňovat nukleotidy před sebou ve směru syntézy. Tato funkce je využívána k odstranění RNA primerů, které jsou nezbytné pro zahájení syntézy, a k jejich nahrazení DNA.

🔑 Požadavky pro funkci

• Templátový řetězec: Jednořetězcová DNA, která slouží jako předloha pro syntézu komplementárního řetězce.
• Primer: Krátký řetězec RNA nebo DNA s volnou 3'-OH skupinou, komplementární k templátu. DNA polymeráza nedokáže zahájit syntézu "na zelené louce" (de novo), pouze prodlužuje již existující řetězec.
• Deoxynukleosidtrifosfáty (dNTPs): Stavební bloky (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), ze kterých se skládá nový řetězec.
• Ionty kovů: Typicky Mg²⁺, které jsou nezbytné pro katalytickou aktivitu enzymu. Stabilizují negativní náboj fosfátových skupin a pomáhají orientovat substráty v aktivním místě.

🔬 Typy DNA polymeráz

Organismy disponují celou řadou různých DNA polymeráz, které jsou rozděleny do několika rodin na základě jejich sekvenční a strukturní podobnosti.

🦠 Prokaryotické DNA polymerázy

U bakterií, jako je E. coli, bylo identifikováno pět hlavních typů:

• DNA polymeráza I (Pol I): Má jak 5'→3' polymerační aktivitu, tak obě exonukleázové aktivity (3'→5' i 5'→3'). Její hlavní rolí je odstraňování RNA primerů a zaplňování vzniklých mezer během replikace a oprav DNA.
• DNA polymeráza II (Pol II): Podílí se především na opravách DNA. Má 3'→5' exonukleázovou aktivitu.
• DNA polymeráza III (Pol III): Je hlavním replikačním enzymem u bakterií. Je to velký komplex složený z mnoha podjednotek, který se vyznačuje vysokou rychlostí (procesivitou) a přesností syntézy. Zajišťuje replikaci většiny genomu.
• DNA polymeráza IV (Pol IV) a V (Pol V): Patří mezi tzv. translezní polymerázy. Jsou schopné syntetizovat DNA i přes poškozená místa v templátu, kde by se klasické polymerázy zastavily. Pracují však s nízkou přesností a často vkládají chybné báze. Jsou součástí tzv. SOS odpovědi buňky na masivní poškození DNA.

🧑‍🔬 Eukaryotické DNA polymerázy

Eukaryotické buňky mají mnohem komplexnější sadu DNA polymeráz, které se označují řeckými písmeny.

• Polymeráza α (alfa): Funguje v komplexu s primázou. Zahajuje syntézu DNA vytvořením krátkého RNA-DNA primeru na vedoucím i opožďujícím se řetězci. Má nízkou procesivitu a je brzy nahrazena jinými polymerázami.
• Polymeráza δ (delta): Přebírá syntézu po Pol α a je hlavním enzymem pro syntézu opožďujícího se řetězce (lagging strand). Má vysokou procesivitu (díky asociaci s proteinem PCNA) a 3'→5' exonukleázovou aktivitu.
• Polymeráza ε (epsilon): Je hlavním enzymem pro syntézu vedoucího řetězce (leading strand). Stejně jako Pol δ má vysokou procesivitu a proofreading aktivitu.
• Polymeráza γ (gamma): Nachází se v mitochondriích a je zodpovědná za replikaci mitochondriálního genomu.
• Ostatní polymerázy (β, ζ, η, θ, ι, κ, λ, μ...): Jedná se o velkou skupinu specializovaných enzymů, které se účastní různých typů oprav DNA, včetně bázové excizní reparace (Pol β) nebo translezní syntézy (např. Pol η, která dokáže správně replikovat přes thyminové dimery způsobené UV zářením).

🔥 Termostabilní DNA polymerázy

Zvláštní kategorií jsou polymerázy izolované z termofilních a hypertermofilních organismů, které žijí v prostředí s vysokou teplotou (např. horké prameny). Tyto enzymy jsou stabilní i při teplotách blížících se 100 °C, což je vlastnost, která je učinila nepostradatelnými pro metodu polymerázové řetězové reakce (PCR).

• Taq polymeráza: Izolována z bakterie Thermus aquaticus. Byla první a je stále nejpoužívanější termostabilní polymerázou. Je rychlá, ale postrádá 3'→5' exonukleázovou aktivitu, takže je relativně náchylná k chybám.
• Pfu polymeráza: Izolována z archea Pyrococcus furiosus. Má proofreading aktivitu, a je tedy výrazně přesnější než Taq polymeráza. Používá se v aplikacích vyžadujících vysokou věrnost kopírování, jako je klonování genů.
• Vent polymeráza: Izolována z Thermococcus litoralis. Další vysoce přesná termostabilní polymeráza.

💡 Využití v biotechnologiích a medicíně

Objev a pochopení funkce DNA polymeráz způsobily revoluci v biologii a medicíně.

🔬 Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je metoda, která umožňuje mnohonásobné zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA. Využívá termostabilní DNA polymerázu k syntéze milionů až miliard kopií cílové sekvence v několika desítkách cyklů. PCR má široké uplatnění v diagnostice infekčních a dědičných chorob, v kriminalistické genetice (profilování DNA), ve vědeckém výzkumu a mnoha dalších oblastech.

🧬 Sekvenování DNA

Tradiční Sangerovo sekvenování je založeno na řízeném ukončení syntézy DNA polymerázou pomocí speciálně modifikovaných nukleotidů (dideoxynukleotidy). I moderní metody sekvenování nové generace (NGS) často využívají DNA polymerázy k syntéze a detekci signálu při čtení sekvence DNA.

💊 Cílená léčba

DNA polymerázy jsou atraktivním cílem pro vývoj léků.

• Antivirotika: Mnoho léků proti virům (např. herpesviry, HIV) funguje jako inhibitory virových DNA polymeráz nebo reverzních transkriptáz (což je typ DNA polymerázy). Příkladem je acyklovir nebo zidovudin (AZT). Tyto látky jsou analogy nukleotidů, které se začlení do rostoucího řetězce, ale chybí jim 3'-OH skupina, což vede k předčasnému ukončení syntézy.
• Protinádorová léčba: Rychle se dělící nádorové buňky jsou závislé na replikaci DNA. Některá cytostatika cílí na proces replikace a poškozují DNA nebo inhibují enzymy, jako jsou DNA polymerázy, a tím zastavují růst nádoru.

🤓 Pro laiky: Jak funguje DNA kopírka?

Představte si DNA jako velmi dlouhý zip, který v sobě nese návod na stavbu celého těla. Když se buňka chce rozdělit, musí tento návod zkopírovat, aby každá nová buňka dostala kompletní sadu instrukcí.

1. Rozepnutí zipu: Nejprve přijde jiný enzym (helikáza) a zip uprostřed rozepne na dvě samostatné poloviny. 2. Přichází kopírka (DNA polymeráza): DNA polymeráza je jako speciální jezdec na zipu. Nasadí se na každou rozepnutou polovinu. 3. Doplňování zoubků: Jak se polymeráza posouvá po staré polovině zipu, bere z okolí volné "zoubky" (stavební kameny DNA) a připojuje je na správná místa podle vzoru. Ke "zoubku" A vždy připojí T, ke "zoubku" G zase C. 4. Kontrola kvality: DNA polymeráza je velmi pečlivá. Pokud omylem připojí špatný zoubek, okamžitě to pozná. Zastaví se, vrátí se o krok zpět, špatný zoubek "vycvakne" a nahradí ho správným. Teprve potom pokračuje dál. 5. Výsledek: Na konci tohoto procesu máme místo jednoho původního zipu dva naprosto identické zipy. Každý z nich má jednu starou polovinu a jednu nově vytvořenou.

Díky této úžasné "molekulární kopírce" s vestavěnou kontrolou kvality je zajištěno, že genetická informace se předává z generace na generaci buněk s neuvěřitelnou přesností.

Šablona:Aktualizováno