Mikroskopie

Rozbalit box

Obsah boxu

Mikroskopie

Mikroskopie je vědní obor a soubor technik využívajících mikroskop k pozorování objektů a detailů struktur, které jsou příliš malé na to, aby byly viditelné pouhým okoem. Jedná se o klíčovou disciplínu v mnoha oblastech vědy a techniky, zejména v biologii, medicíně, materiálových vědách a nanotechnologii. Mikroskopie se nezabývá pouze zvětšením obrazu, ale především dosažením dostatečného rozlišení, které umožňuje odlišit dva blízko sebe ležící body.

Základní dělení mikroskopie je podle typu záření (nebo částic), které se používá k zobrazení vzorku. Nejznámější je světelná mikroskopie, která využívá viditelné světlo, a elektronová mikroskopie, která k zobrazení používá svazek elektronů.

📜 Historie

Historie mikroskopie je úzce spjata s vývojem optiky a výrobou čoček.

🏛️ První objevy (16.–17. století)

Ačkoliv jednoduché zvětšovací čočky byly známy již ve starověku, za vynálezce prvního složeného mikroskopu (kombinujícího objektiv a okulár) jsou považováni nizozemští výrobci brýlí Hans a Zacharias Janssenové kolem roku 1590. Tyto rané přístroje však trpěly silnými optickými vadami a poskytovaly jen malé zvětšení.

Skutečný průlom přišel v 17. století. Galileo Galilei upravil svůj dalekohled pro pozorování malých objektů. Klíčovými postavami se však stali:

• Robert Hooke: Ve své knize Micrographia (1665) poprvé zobrazil a popsal detailní kresby pozorovaných objektů, jako byl hmyz nebo korek. Právě při pozorování korku zavedl termín „buňka“ (cellula) pro malé komůrky, které mu připomínaly cely v klášteře.
• Antoni van Leeuwenhoek: Nizozemský obchodník a amatérský vědec, který dovedl k dokonalosti výrobu jednoduchých, ale velmi silných čoček. Se svými jedočočkovými mikroskopy dosáhl zvětšení až 270× a jako první na světě pozoroval a popsal mikroorganismy (které nazval animalcules), bakterie, spermie a červené krvinky. Je považován za „otce mikrobiologie“.

🔬 Zdokonalování v 18. a 19. století

Během 18. století se mikroskopy příliš nevyvíjely, hlavním problémem zůstávaly optické vady, zejména sférická a chromatická vada. Zásadní zlepšení přineslo až 19. století:

• Joseph Jackson Lister v roce 1830 vyvinul achromatické objektivy, které výrazně snížily chromatickou vadu a umožnily ostřejší zobrazení.
• Ernst Abbe, německý fyzik pracující pro společnost Carl Zeiss, v 70. letech 19. století formuloval teorii zobrazení v mikroskopu a definoval fyzikální limit rozlišení světelného mikroskopu (tzv. Abbeho difrakční limit). Jeho práce umožnila systematický a vědecký návrh mikroskopů, které dosahovaly teoretického maxima svých možností.

⚛️ Moderní éra (20. a 21. století)

20. století přineslo revoluční změny a vznik zcela nových typů mikroskopie:

• 1931: Ernst Ruska a Max Knoll zkonstruovali první transmisní elektronový mikroskop (TEM), který k zobrazení využil svazek elektronů místo světla. Jelikož vlnová délka elektronů je mnohem kratší než vlnová délka světla, umožnil tento vynález řádově vyšší rozlišení.
• 1932: Frits Zernike vynalezl mikroskopii s fázovým kontrastem, která umožnila pozorovat živé, neobarvené buňky a tkáně, jež jsou v běžném světelném mikroskopu téměř neviditelné. Za tento objev obdržel v roce 1953 Nobelovu cenu za fyziku.
• 1955: Georges Nomarski vylepšil techniku kontrastu vynálezem diferenciálního interferenčního kontrastu (DIC).
• 1981: Gerd Binnig a Heinrich Rohrer vyvinuli skenovací tunelovací mikroskop (STM), první z rodiny mikroskopů skenující sondou (SPM). Tento přístroj umožnil zobrazit povrchy materiálů s atomárním rozlišením. V roce 1986 za něj obdrželi Nobelovu cenu.
• 1986: Byl vyvinut mikroskop atomárních sil (AFM), který na rozdíl od STM může zobrazovat i nevodivé vzorky.
• Konec 20. a začátek 21. století: Vývoj superrezoluční fluorescenční mikroskopie (např. STED, PALM, STORM) umožnil překonat Abbeho difrakční limit i ve světelné mikroskopii a zobrazit struktury menší než 200 nanometrů. Eric Betzig, Stefan Hell a William Moerner za tento přínos získali v roce 2014 Nobelovu cenu za chemii.

⚙️ Princip a základní pojmy

Kvalita mikroskopického zobrazení závisí na třech klíčových parametrech: zvětšení, rozlišení a kontrast.

• Zvětšení (magnifikace): Udává, kolikrát je obraz pozorovaného objektu větší než objekt samotný. U složeného mikroskopu je celkové zvětšení dáno součinem zvětšení objektivu a zvětšení okuláru. Samotné zvětšení je však bezcenné bez dostatečného rozlišení.
• Rozlišovací schopnost (rozlišení): Je nejdůležitějším parametrem mikroskopu. Definuje minimální vzdálenost dvou bodů, které lze ještě v obraze odlišit jako samostatné body. Rozlišení je fyzikálně omezeno difrakcí (ohybu) světla. Pro světelný mikroskop je tento limit dán tzv. Abbeho kritériem:

$d=\frac{\lambda }{2n\sin \alpha }=\frac{\lambda }{2\text{NA}}$

kde d je minimální rozlišitelná vzdálenost, λ je vlnová délka použitého světla, n je index lomu prostředí mezi objektivem a vzorkem (pro vzduch ≈ 1, pro imerzní olej až 1,5) a α je polovina vrcholového úhlu kužele světla vstupujícího do objektivu. Výraz n sinα se nazývá numerická apertura (NA) a je klíčovým parametrem kvality objektivu.

• Kontrast: Udává rozdíl v jasu nebo barvě mezi detailem a jeho okolím. Mnoho biologických vzorků (např. živé buňky) je téměř průhledných a má velmi nízký kontrast. Proto byly vyvinuty speciální techniky (fázový kontrast, DIC, barvení) pro jeho zvýšení.

🔬 Typy mikroskopie

Mikroskopy lze dělit podle mnoha kritérií, nejčastěji podle použitého "zobrazovacího média".

Světelná (optická) mikroskopie

Využívá fotony viditelného světla. Je to nejstarší a nejrozšířenější typ mikroskopie. Umožňuje pozorování živých i fixovaných vzorků. Maximální teoretické rozlišení je kolem 200 nm.

• Mikroskopie v procházejícím světle (Bright-field): Nejzákladnější technika. Světlo prochází vzorkem a je zachyceno objektivem. Vzorek se jeví jako tmavší na světlém pozadí. Vhodná pro pozorování obarvených vzorků.
• Mikroskopie v temném poli (Dark-field): Kondenzor je upraven tak, aby přímé světlo neprošlo do objektivu. Do objektivu se dostane pouze světlo rozptýlené na strukturách vzorku. Výsledkem je jasný obraz objektu na tmavém pozadí. Vhodné pro pozorování malých neobarvených částic, např. bakterií.
• Fázový kontrast: Technika, která převádí fázové posuny světla procházejícího vzorkem (způsobené rozdílným indexem lomu částí vzorku) na viditelné rozdíly v jasu. Umožňuje pozorovat živé, neobarvené buňky.
• Diferenciální interferenční kontrast (DIC, Nomarski): Podobně jako fázový kontrast využívá interference světla, ale vytváří pseudo-3D reliéfní obraz. Poskytuje vynikající kontrast a rozlišení detailů.
• Fluorescenční mikroskopie: Využívá jevu fluorescence. Vzorek je označen fluorofory (fluorescenčními barvivy nebo proteiny jako GFP), které po ozáření světlem o specifické vlnové délce (excitační světlo) emitují světlo o delší vlnové délce (emisní světlo). To umožňuje specificky zobrazit jen určité struktury (např. cytoskelet, jádro).
  • Konfokální mikroskopie**: Pokročilá forma fluorescenční mikroskopie, která pomocí clonky odstraňuje neostré světlo z rovin mimo ohnisko. Výsledkem jsou velmi ostré optické řezy, ze kterých lze složit 3D obraz.
  • Superrezoluční mikroskopie**: Soubor technik (např. STED, PALM, STORM), které různými fyzikálními principy překonávají difrakční limit a dosahují rozlišení v řádu desítek nanometrů.

Elektronová mikroskopie

Využívá svazek elektronů, jejichž vlnová délka je mnohem kratší než u světla, což umožňuje dosáhnout mnohem vyššího rozlišení (až na úroveň jednotlivých atomů). Nevýhodou je nutnost pracovat ve vysokém vakuu a pozorovat pouze neživé, speciálně připravené (fixované, odvodněné, pokovené) vzorky.

• Transmisní elektronový mikroskop (TEM): Svazek elektronů prochází ultratenkým řezem vzorku (tloušťka 50–100 nm). Části vzorku s vyšší hustotou (těžší atomy) elektrony více rozptylují a jeví se jako tmavé, zatímco méně husté oblasti jsou světlé. Poskytuje 2D projekci vnitřní struktury vzorku s extrémně vysokým rozlišením.
• Rastrovací elektronový mikroskop (SEM): Svazek elektronů neprochází vzorkem, ale skenuje (rastruje) jeho povrch. Interakce elektronů s povrchem generuje různé signály (sekundární elektrony, zpětně odražené elektrony, rentgenové záření), které jsou detekovány a použity k sestavení obrazu. Poskytuje detailní 3D obraz povrchu vzorku s velkou hloubkou ostrosti.

Mikroskopie skenující sondou (SPM)

Tato rodina technik nezobrazuje vzorek pomocí záření, ale "osahává" jeho povrch miniaturním hrotem (sondou). Umožňuje dosáhnout atomárního rozlišení.

• Mikroskopie atomárních sil (AFM): Ostrý hrot na konci pružného raménka (cantilever) skenuje povrch vzorku. Síly mezi hrotem a atomy na povrchu (např. Van der Waalsova síla) způsobují prohnutí raménka, které je detekováno laserovým paprskem. Umožňuje měřit topografii povrchu s vysokým rozlišením a lze ji použít i v kapalném prostředí.
• Skenovací tunelovací mikroskopie (STM): Využívá kvantově-mechanického jevu zvaného tunelový jev. Mezi vodivý hrot a vodivý vzorek je přivedeno malé napětí. Když se hrot přiblíží na vzdálenost několika atomů, začne protékat malý tunelovací proud, který je extrémně citlivý na vzdálenost. Udržováním konstantního proudu a sledováním pohybu hrotu lze zmapovat povrch s atomárním rozlišením.

🧪 Příprava vzorků

Správná příprava vzorku (preparátu) je často stejně důležitá jako samotný mikroskop. Cílem je zachovat strukturu vzorku co nejvěrněji a učinit ji viditelnou.

• Fixace: Proces, který zastaví biologické procesy (autolýzu) a zpevní strukturu vzorku. Používají se chemické fixativy (např. formaldehyd, glutaraldehyd) nebo fyzikální metody (zmrazení).
• Zalévání: Po odvodnění (např. v ethanolové řadě) je vzorek prosycen médiem (např. parafín pro světelnou mikroskopii, pryskyřice pro elektronovou), které mu dodá pevnost pro krájení.
• Krájení: Zhotovení tenkých řezů pomocí mikrotomu (pro světelnou mikroskopii, tloušťka v řádu mikrometrů) nebo ultramikrotomu (pro TEM, tloušťka v řádu desítek nanometrů).
• Barvení: Většina biologických struktur je bezbarvá. Používají se proto specifická barviva, která se vážou na určité struktury a zvyšují tak kontrast. Příkladem je barvení hematoxylin a eosin v histologii nebo použití solí těžkých kovů (uran, olovo) pro zvýšení kontrastu v TEM.

🌍 Aplikace a využití

Mikroskopie je nepostradatelná v mnoha oborech:

• Biologie a Medicína: Studium buněk (cytologie), tkání (histologie), mikroorganismů (mikrobiologie), diagnostika nemocí (patologie), vývojová biologie, neurovědy.
• Materiálové vědy: Analýza mikrostruktury kovů (metalografie), polymerů, keramiky a kompozitů, kontrola kvality, vývoj nových materiálů.
• Nanotechnologie: Zobrazování a manipulace s nanočásticemi, nanostrukturami a jednotlivými molekulami.
• Geologie: Studium minerálů a hornin v tenkých výbrusech (polarizační mikroskopie).
• Forenzní věda: Analýza vláken, vlasů, stop střelného prachu a dalších důkazních materiálů.
• Elektronika: Kontrola a analýza poruch integrovaných obvodů a polovodičových součástek.

💡 Pro laiky

Představte si, že se díváte na noviny z velké dálky. Vidíte jen šedou plochu. Když se přiblížíte (zvětšení), začnete rozeznávat řádky a pak i jednotlivá písmena. Ale i když se budete dívat zblízka, nikdy neuvidíte jednotlivé tečky inkoustu, ze kterých jsou písmena složena, protože vaše oko na to nemá dostatečné rozlišení. Mikroskop je nástroj, který poskytuje nejen velké zvětšení, ale hlavně mnohem vyšší rozlišení než lidské oko.

Proč nemůžeme vidět atomy běžným mikroskopem? Světlo se chová jako vlna. Když se tato vlna setká s objektem, který je mnohem menší než její vlnová délka, jednoduše ho "obepluje" a nezobrazí ho. Je to podobné, jako když se velká mořská vlna převalí přes malý kamínek, aniž by se její tvar výrazně změnil. Vlnová délka viditelného světla je asi 400–700 nanometrů, zatímco atomy jsou velké jen zlomky nanometru. Proto je světlo příliš "hrubé" na to, aby je zobrazilo. Elektronové mikroskopy používají elektrony, jejichž vlnová délka je tisíckrát kratší, a proto mohou zobrazit i takto malé struktury.

Šablona:Aktualizováno