CRISPR

Rozbalit box

Obsah boxu

CRISPR (výslovnost [krispr]; zkratka z anglického Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) je revoluční technologie genetického inženýrství, která umožňuje vědcům s vysokou přesností a relativně snadno upravovat genomy živých organismů. Původně se jedná o přirozený imunitní systém bakterií a archeí, který jim slouží k obraně proti cizorodým genetickým elementům, jako jsou viry. Vědci tento mechanismus adaptovali do podoby mocného nástroje, často přirovnávaného k "molekulárním nůžkám", které dokáží cíleně stříhat a modifikovat DNA na předem určených místech.

Nejznámějším systémem je CRISPR-Cas9, který využívá enzym Cas9 naváděný krátkým úsekem RNA (tzv. vodicí RNA neboli gRNA) na specifické místo v genomu. Po navázání na cílovou sekvenci enzym Cas9 přestřihne dvoušroubovici DNA. Buňka se následně snaží poškození opravit, což vědcům umožňuje do místa střihu vložit novou genetickou informaci, nebo naopak vyřadit funkci původního genu.

Za vývoj této metody získaly Emmanuelle Charpentierová a Jennifer Doudnaová v roce 2020 Nobelovu cenu za chemii. Technologie CRISPR má obrovský potenciál v medicíně, zemědělství i základním výzkumu a je považována za jeden z největších vědeckých průlomů 21. století.

⏳ Historie a objev

Cesta k objevu CRISPR jako nástroje pro editaci genů byla postupná a podílela se na ní řada vědců z celého světa.

1987: První pozorování neobvyklých opakujících se sekvencí v DNA bakterie Escherichia coli japonským vědcem Yoshizumim Ishinou, jejich funkce však zůstala neznámá.
90. léta - 2005: Španělský vědec Francisco Mojica jako první systematicky studoval tyto sekvence, které v roce 2002 pojmenoval CRISPR. V roce 2005 publikoval klíčovou hypotézu, že tyto sekvence souvisí s imunitou bakterií proti virům, jelikož části sekvencí (tzv. "spacery") odpovídaly virové DNA.
2007-2011: Několik výzkumných skupin experimentálně potvrdilo, že systém CRISPR-Cas skutečně funguje jako adaptivní imunitní systém. Bylo prokázáno, že enzymy Cas stříhají virovou DNA na místech určených sekvencemi uloženými v CRISPR oblasti.
2012: Zásadní průlom přišel s publikací studie týmu Emmanuelle Charpentierové a Jennifer Doudnaové (na které se významně podílel i český vědec Martin Jínek). Prokázaly, že systém CRISPR-Cas9 lze zjednodušit a přeprogramovat tak, aby cílil na jakoukoli libovolnou sekvenci DNA pomocí jediné molekuly "vodicí RNA" (sgRNA). Tím se z bakteriálního imunitního systému stal univerzální a snadno použitelný nástroj pro editaci genomu. Nezávisle na nich k podobným závěrům dospěl i litevský vědec Virginijus Šikšnys.

🧬 Jak CRISPR-Cas9 funguje

Princip metody CRISPR-Cas9 je elegantně jednoduchý a skládá se ze dvou klíčových komponent:

Enzym Cas9 (CRISPR-associated protein 9): Funguje jako "molekulární nůžky", které jsou schopny přestřihnout oba řetězce dvoušroubovice DNA. Sám o sobě je však "slepý" a neví, kde má stříhat.
Vodicí RNA (guide RNA, gRNA): Je krátká, uměle vytvořená molekula RNA, která slouží jako navigátor. Skládá se ze dvou částí:
- Naváděcí sekvence (~20 nukleotidů): Je navržena tak, aby byla komplementární k cílové sekvenci v genomu, kterou chceme upravit. Tato část je zodpovědná za přesné nalezení cíle.
- Strukturní část: Váže se na enzym Cas9 a tvoří s ním stabilní komplex.

Proces úpravy probíhá v několika krocích:

Komplex Cas9-gRNA je dopraven do buňky (např. pomocí plazmidu nebo virového vektoru).
Uvnitř jádra komplex prohledává DNA, dokud nenajde sekvenci, která odpovídá naváděcí části gRNA.
Po navázání na cílové místo enzym Cas9 přestřihne oba řetězce DNA a vytvoří tzv. dvouřetězcový zlom.
Buňka okamžitě aktivuje své přirozené opravné mechanismy, aby zlom zacelila. Vědci mohou tento proces využít dvěma hlavními způsoby:
- Vyřazení genu (Knock-out): Nejčastěji buňka použije mechanismus zvaný nehomologní spojování konců (NHEJ), který je náchylný k chybám. Často při něm dojde k vložení nebo ztrátě několika nukleotidů, což vede k narušení genu a ztrátě jeho funkce.
- Vložení/oprava genu (Knock-in): Pokud se buňce spolu s komplexem CRISPR-Cas9 dodá i templátová (vzorová) DNA s požadovanou sekvencí, může buňka použít přesnější mechanismus zvaný homologicky řízená oprava (HDR). Tímto způsobem lze opravit chybný gen nebo vložit zcela nový.

🔬 Aplikace a využití

Díky své jednoduchosti, cenové dostupnosti a přesnosti způsobil CRISPR revoluci v mnoha oblastech vědy a techniky.

⚕️ Medicína a terapie

Největší naděje jsou vkládány do léčby genetických onemocnění.

Léčba monogenních chorob: První schválenou terapií na bázi CRISPR se na konci roku 2023 stala léčba Casgevy, určená pro pacienty se srpkovitou anémií a β-talasémií. Terapie funguje tak, že se pacientovi odeberou kmenové buňky kostní dřeně, v laboratoři se v nich pomocí CRISPR opraví gen pro hemoglobin a následně se buňky vrátí pacientovi.
Boj s rakovinou: Vyvíjejí se imunoterapie, kde jsou T-lymfocyty pacienta pomocí CRISPR upraveny tak, aby lépe rozpoznávaly a ničily nádorové buňky.
Virové infekce: Zkoumá se možnost využití CRISPR k "vystřižení" genomu virů, jako je HIV, z DNA infikovaných buněk.
Diagnostika: Systémy založené na CRISPR (např. s enzymem Cas13) se používají pro rychlou a citlivou detekci virových RNA, včetně viru SARS-CoV-2.

🌽 Zemědělství a potravinářství

CRISPR umožňuje rychlé a cílené šlechtění plodin a hospodářských zvířat.

Zvýšení odolnosti plodin: Vytváření rostlin odolných vůči suchu, škůdcům nebo herbicidům. Příkladem jsou rajčata nebo rýže s vylepšenými vlastnostmi.
Zlepšení kvality potravin: Úprava plodin tak, aby měly vyšší obsah vitamínů, delší trvanlivost nebo neobsahovaly alergeny.
Živočišná výroba: Šlechtění hospodářských zvířat odolných vůči nemocem, například prasat rezistentních vůči viru PRRS.

🧪 Základní výzkum

CRISPR se stal nepostradatelným nástrojem v laboratořích po celém světě pro studium funkce genů. Vědci mohou snadno a rychle "vypnout" konkrétní gen v buňce nebo modelovém organismu (např. u myši nebo dania pruhovaného) a sledovat, jaký to bude mít dopad. To zásadně urychluje pochopení biologických procesů a příčin nemocí.

💡 Varianty a nové systémy CRISPR

Původní systém CRISPR-Cas9 se neustále vylepšuje a vznikají nové, ještě přesnější varianty:

Bázoví editoři (Base Editing): Tyto systémy nevyžadují přestřižení obou řetězců DNA. Místo toho dokáží enzymaticky přeměnit jedno písmeno genetického kódu (bázi) na jiné (např. cytosin na thymin). To snižuje riziko nechtěných mutací.
Prvotní editorování (Prime Editing): Ještě pokročilejší metoda, přirovnávaná k funkci "najít a nahradit" v textovém editoru. Umožňuje přepsat delší úseky DNA, vkládat nové sekvence nebo odstraňovat chybné bez nutnosti dvouřetězcového zlomu a bez dodání externí templátové DNA.
Jiné Cas enzymy: Kromě Cas9 se zkoumají i jiné enzymy, jako je Cas12 nebo Cas13, které se zaměřují na RNA místo DNA, což umožňuje dočasné a vratné úpravy genové exprese.
Systémy objevované pomocí AI: V roce 2024 vědci s pomocí umělé inteligence začali navrhovat zcela nové systémy pro úpravu genů, které v přírodě neexistují, což dále rozšiřuje možnosti této technologie.

⚖️ Etické a společenské otázky

Síla a dostupnost technologie CRISPR vyvolává řadu závažných etických otázek, které jsou předmětem celosvětové debaty.

Editace zárodečné linie (Germline editing): Největší kontroverzi vzbuzuje možnost úpravy DNA v lidských spermiích, vajíčkách nebo embryích. Takové změny by byly dědičné a přenášely by se na další generace, čímž by se trvale zasáhlo do lidského genofondu.
"Děti na míru" (Designer babies): Existují obavy ze zneužití technologie nejen k léčbě nemocí, ale i k "vylepšování" lidských vlastností, jako je inteligence, vzhled nebo sportovní výkonnost. To by mohlo vést k prohloubení sociální nerovnosti.
Bezpečnost a nezamýšlené důsledky: Přestože je CRISPR velmi přesný, stále existuje riziko tzv. "off-target" efektů, tedy zásahů na nechtěných místech v genomu, které by mohly mít nepředvídatelné zdravotní následky.
Případ Che Ťien-kchueje: V roce 2018 čínský vědec Che Ťien-kchuej oznámil narození prvních geneticky upravených dětí na světě, u kterých se pokusil vytvořit rezistenci vůči viru HIV. Tento experiment, provedený v utajení a v rozporu s etickými principy, byl globálně odsouzen vědeckou komunitou a vedl k volání po přísnější regulaci.

👨‍🏫 Pro laiky: CRISPR vysvětlený jednoduše

Představte si, že DNA je obrovská kniha receptů (encyklopedie), která obsahuje všechny instrukce pro fungování živého organismu, například člověka. Každý recept je jeden gen. Občas se stane, že je v některém receptu tisková chyba (mutace), která způsobí, že výsledný "pokrm" (např. bílkovina) nefunguje správně, což vede k nemoci.

CRISPR je jako kouzelný nástroj, který kombinuje vyhledávač a nůžky. 1. Do vyhledávače (to je ta vodicí RNA) napíšete přesnou větu s chybou, kterou chcete v knize najít. 2. Vyhledávač projede celou obrovskou encyklopedii a zastaví se přesně na stránce a řádku, kde se chyba nachází. 3. V tu chvíli přijdou na řadu nůžky (enzym Cas9), které jsou k vyhledávači připevněné, a chybnou větu vystřihnou.

Co se stane dál? Buňka se snaží díru zalepit. Buď to udělá trochu nešikovně, čímž celý recept znefunkční (to se hodí, když chceme nějaký škodlivý gen vypnout), anebo jí můžeme podstrčit lísteček se správným textem. Buňka pak tento správný text použije jako záplatu a chybu v receptu trvale opraví. Tímto způsobem můžeme léčit nemoci způsobené "překlepy" v naší genetické knize.

Zdroje