Chromatografie

Rozbalit box

Obsah boxu

Chromatografie (z řeckého χρῶμα (chrōma) – barva a γράφειν (graphein) – psát) je soubor fyzikálně-chemických separačních metod, jejichž společným principem je rozdělování složek směsi mezi dvě fáze: stacionární fázi (nepohyblivou) a mobilní fázi (pohyblivou). Mobilní fáze unáší vzorek přes stacionární fázi a jednotlivé složky vzorku (tzv. analyty) jsou na stacionární fázi různou měrou zadržovány (mají k ní různou afinitu), což vede k jejich postupnému oddělení.

Jedná se o jednu z nejvýznamnějších a nejuniverzálnějších analytických a preparačních technik, která nachází uplatnění v téměř všech oblastech chemie, biologie, medicíny, farmacie a vědy o životním prostředí. Umožňuje nejen oddělit jednotlivé látky z velmi složitých směsí, ale také je identifikovat a stanovit jejich množství (koncentraci).

📜 Historie

Za objevitele chromatografie je považován rusko-italský botanik Michail Semjonovič Cvet, který kolem roku 1900 prováděl experimenty s rostlinnými pigmenty. Naplnil skleněnou trubici (kolonu) uhličitanem vápenatým (CaCO₃) a nechal jí protékat extrakt z listů rostlin rozpuštěný v petroletheru. Během experimentu pozoroval, že původně jednolitý zelený extrakt se rozdělil na několik barevných pásů – žluté karotenoidy a zelené chlorofyly. Protože metoda vedla k "zápisu barev", nazval ji chromatografie.

Cvetova práce byla na několik desetiletí téměř zapomenuta. Zásadní průlom a renesance chromatografie nastala až ve 40. a 50. letech 20. století díky práci britských chemiků Archera Martina a Richarda Syngeho. Ti v roce 1941 popsali princip rozdělovací chromatografie a později vyvinuli papírovou chromatografii. Za svůj přínos k rozvoji této metody obdrželi v roce 1952 Nobelovu cenu za chemii. Jejich práce položila teoretické základy pro moderní techniky, jako je plynová chromatografie (GC) a vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC).

⚙️ Princip metody

Základem každé chromatografické separace je distribuce složek vzorku mezi dvě nemísitelné fáze.

• Stacionární fáze: Je nepohyblivá fáze, která může být pevná látka (např. silikagel, oxid hlinitý) nebo kapalina zakotvená na pevném nosiči. Má schopnost interagovat se složkami vzorku prostřednictvím různých fyzikálně-chemických sil (např. adsorpce, iontová výměna, hydrofobní interakce).
• Mobilní fáze: Je pohyblivá fáze, která může být kapalina (v kapalinové chromatografii) nebo plyn (v plynové chromatografii). Jejím úkolem je transportovat vzorek přes stacionární fázi.

Když mobilní fáze se vzorkem prochází stacionární fází, molekuly jednotlivých složek neustále přecházejí mezi oběma fázemi. Složky, které mají silnější interakci (afinitu) se stacionární fází, se pohybují pomaleji. Naopak složky, které preferují mobilní fázi, postupují systémem rychleji. Tento proces, nazývaný eluce, vede k postupnému oddělování složek.

Výsledkem chromatografické separace je typicky chromatogram, což je graf závislosti signálu detektoru na čase nebo objemu mobilní fáze. Každý pík na chromatogramu odpovídá jedné oddělené složce. Doba, kterou složka stráví v systému od nástřiku po detekci, se nazývá retenční čas a je pro danou látku za daných podmínek charakteristická.

📊 Dělení chromatografických metod

Chromatografické metody lze dělit podle několika kritérií, která se často prolínají.

Podle skupenství mobilní fáze

• Kapalinová chromatografie (LC): Mobilní fází je kapalina. Je to velmi univerzální metoda vhodná pro široké spektrum látek, včetně těch netěkavých a termolabilních. Moderní variantou je vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC).
• Plynová chromatografie (GC): Mobilní fází je inertní plyn (např. helium, dusík, argon). Používá se pro separaci těkavých a termicky stabilních látek.
• Superkritická fluidní chromatografie (SFC): Mobilní fází je látka v superkritickém stavu (nejčastěji oxid uhličitý). Kombinuje výhody GC a LC.

Podle uspořádání stacionární fáze

• Sloupcová (kolonová) chromatografie: Stacionární fáze je umístěna v trubici (koloně). Jedná se o nejběžnější uspořádání, používané v GC i LC.
• Planární (plošná) chromatografie: Stacionární fáze je nanesena v tenké vrstvě na rovné podložce (desce nebo papíru).

   *   Papírová chromatografie: Stacionární fází je voda vázaná na celulózových vláknech papíru.
   *   Tenkovrstvá chromatografie (TLC): Stacionární fáze (např. silikagel) je nanesena na skleněné, hliníkové nebo plastové desce.

Podle separačního mechanismu

• Adsorpční chromatografie: Separace je založena na rozdílné adsorpci analytů na povrch pevné stacionární fáze.
• Rozdělovací chromatografie: Separace probíhá na základě rozdílné rozpustnosti analytů ve stacionární a mobilní fázi (obě jsou kapaliny).
• Iontově-výměnná chromatografie (IEX): Stacionární fáze nese nabité funkční skupiny, které interagují s ionty analytu s opačným nábojem. Používá se pro separaci iontových sloučenin, jako jsou aminokyseliny, peptidy a nukleové kyseliny.
• Velikostně-exkluzní chromatografie (SEC): Stacionární fáze je porézní materiál, který odděluje molekuly podle jejich velikosti. Velké molekuly procházejí rychleji, zatímco menší molekuly se zdržují v pórech. Používá se pro analýzu a separaci polymerů a biopolymerů.
• Afinitní chromatografie: Využívá vysoce specifické interakce mezi analytem a ligandem imobilizovaným na stacionární fázi (např. interakce antigen–protilátka nebo enzym–substrát). Je to velmi selektivní metoda používaná hlavně v biochemii.

🔬 Klíčové techniky a jejich využití

Plynová chromatografie (GC)

GC je výkonná technika pro analýzu plynných a těkavých látek. Vzorek je zplyněn v injektoru a unášen proudem inertního plynu (mobilní fáze) přes dlouhou, tenkou kapilární kolonu umístěnou v peci. Na konci kolony jsou oddělené složky detekovány. Často se kombinuje s hmotnostní spektrometrií (GC-MS), což umožňuje jednoznačnou identifikaci látek.

• Využití: Analýza pesticidů a znečištění v životním prostředí, kontrola kvality v petrochemickém průmyslu, analýza vonných látek v potravinách a kosmetice, dopingové testy ve sportu.

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)

HPLC je v současnosti nejpoužívanější chromatografickou technikou. Mobilní fáze (kapalina) je pod vysokým tlakem (až stovky barů) protlačována kolonou naplněnou velmi jemnými částicemi stacionární fáze. To umožňuje velmi rychlou a účinnou separaci. Moderní varianta, ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie (UHPLC), používá ještě menší částice a vyšší tlaky, což dále zvyšuje rychlost a rozlišení.

• Využití: Kontrola kvality a čistoty léčiv ve farmaceutickém průmyslu, stanovení vitamínů a konzervantů v potravinách, analýza drog a metabolitů v biologických vzorcích (krev, moč), purifikace proteinů a dalších biomolekul.

Tenkovrstvá chromatografie (TLC)

TLC je jednoduchá, rychlá a levná planární technika. Vzorek se nanese jako malá skvrna na startovní čáru TLC desky. Deska se poté vloží do vyvíjecí komory s malým množstvím mobilní fáze (vyvíjecího činidla). Kapalina vzlíná po desce vzhůru a unáší s sebou složky vzorku, které se oddělují. Po vyvinutí se poloha skvrn vizualizuje (např. pod UV světlem).

• Využití: Rychlá kontrola čistoty látek, sledování průběhu chemických reakcí, kvalitativní screeningová analýza (např. pro identifikaci drog).

💡 Praktické využití

Chromatografie je nepostradatelným nástrojem v mnoha odvětvích:

• Farmaceutický průmysl: Izolace a purifikace aktivních látek, kontrola čistoty léčiv, stanovení stability a doby použitelnosti léků.
• Ochrana životního prostředí: Monitorování znečišťujících látek (pesticidy, PCB, těžké kovy) ve vodě, půdě a ovzduší.
• Potravinářství: Stanovení obsahu živin, vitamínů, cukrů, konzervantů, barviv a kontaminantů (např. mykotoxinů) v potravinách.
• Klinická diagnostika: Analýza biologických tekutin (krev, moč) pro diagnostiku nemocí, sledování hladin léků v těle pacientů.
• Forenzní vědy: Identifikace drog, analýza stop z místa činu (vlákna, inkousty), testování na přítomnost alkoholu v dechu.
• Biotechnologie: Purifikace rekombinantních proteinů, monoklonálních protilátek a dalších produktů biologického inženýrství.

🧪 Pro laiky

Představte si chromatografii jako závod běžců na trati s různým povrchem.

• Běžci jsou jednotlivé složky směsi, kterou chceme rozdělit (např. různé barvy v černém fixu).
• Trať je stacionární fáze (např. savý papír).
• Startovní výstřel a vítr v zádech je mobilní fáze (např. voda nebo alkohol, který po papíru vzlíná).

Když se černá skvrna od fixu na papíře namočí do vody, voda (mobilní fáze) začne stoupat a unáší s sebou jednotlivá barviva (běžce). Každé barvivo má ale jiný vztah k papíru (trati). Některé se papíru "drží" více a běží pomaleji (např. modrá), jiné se ho drží méně a nechají se vodou unášet rychleji (např. žlutá). Výsledkem je, že po chvíli se původně jediná černá skvrna rozdělí na barevné pruhy – modrý zůstane blízko startu, zatímco žlutý doběhne nejdále. Tím jsme od sebe jednotlivé barvy oddělili – provedli jsme chromatografii. V laboratoři se tento princip používá s mnohem sofistikovanějším vybavením k dělení i bezbarvých a velmi složitých směsí.

⏰ Tento článek je aktuální k datu 24.12.2025